10 reactivos y accesorios para utilizar en la técnica de Western Blot


10 reactivos y accesorios para utilizar en la técnica de Western BlotLa técnica de Western Blot es una de las más eficaces para transferir proteínas. Desde su descubrimiento ha venido perfeccionándose y aumentando el número de experimentos en los que se utiliza, fundamentalmente en investigaciones de Biología Molecular, Inmunología y Biotecnología. Su nombre proviene de las similitudes de este procedimiento con el desarrollado anteriormente por un profesor de apellido Southern, conocido como Southern Blotting. Para transferir proteínas mediante el método de Western Blot se realiza inicialmente una electroforesis sobre gel de acrilamida que permite la separación de las proteínas contenidas en una muestra y luego se aplica un campo eléctrico perpendicular al gel que contiene las proteínas y se transfieren a una membrana nitrocelulósica o de polifluoruro de vinilideno. Al pasar a la membrana se puede proceder a la identificación de las proteínas que se encuentran más accesibles y pueden interactuar con las moléculas que se usan en el paso de identificación.

La identificación de las proteínas en Western Blot se realiza normalmente usando anticuerpos, en muchas ocasiones un anticuerpo primario y uno secundario. De aquí que esta técnica también sea denominada “immunoblot”. Lo que se produce cuando una mezcla de proteínas entra en contacto con anticuerpos es un reconocimiento supramolecular que permite la interacción específica según los grupos funcionales que contienen las proteínas con el anticuerpo que efectúa el reconocimiento. Al igual que en la naturaleza en estos ensayos las reacciones que se producen entre los anticuerpos y las proteínas presentes en la muestra en estudio son específicas. Por lo tanto, seleccionando los anticuerpos con los que se pone en contacto la membrana se pueden detectar solo las proteínas que interaccionan específicamente con ellos, de aquí la utilidad de este método, tanto para detectar en una muestra compleja una o varias proteínas de interés como para realizar el seguimiento de la expresión de proteínas durante el transcurso de los ensayos.

Una vez realizado el proceso de tinción de las membranas de Western Blot se procede a la detección de las proteínas que se encuentran en las franjas coloreadas. Es frecuente realizar la detección por colorimetría, o sea midiendo la intensidad del color de cada una de las franjas.

1. PBS-T

El PBS-T es una disolución de lavado que contiene un buffer y se utiliza tanto para el Western blotting como para las placas de ELISA. Con la disolución de lavado se asegura que la placa a analizar contenga solo la mezcla de proteínas de la mezcla inicial y no otros componentes.

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2. Reactivo Multi Capture HRP – Anticuerpo de detección

Mediante el uso del reactivo Multi Capture HRP se pueden detectar los anticuerpos que se unen a las proteínas. La detección se puede realizar por quimioluminiscencia, ya que el reactivo está marcado con la proteína luminiscente HRP. La sensibilidad que se logra al usar el reactivo Multi Capture es similar a la obtenida con anticuerpos secundarios disponibles en el mercado. En el kit se incluye un reactivo para el caso específico de la detección de IgG1 de ratón que puede ser difícil de detectar sin la ayuda de este reactivo auxiliar.

3. Immunoenhancer (Potenciador de la reacción inmunológica)

Con este reactivo se logra acelerar la reacción entre el antígeno y el anticuerpo en el Western Blot y otras técnicas inmunoquímicas. Puede ser aplicado en forma simultánea con los diluyentes de los anticuerpos listos para el uso.

4. Skim Blocker

El Skim Blocker tiene como función principal evitar la absorción no específica en las membranas o las placas de ELISA. Debe usarse inmediatamente después de abrirse el frasco que lo contiene, y agitándolo durante media hora con la muestra a temperatura ambiente se logra que realice su función. Los reactivos bloqueadores más usuales son el suero de albúmina bobino y la leche desnatada. La leche desnatada no puede usarse en muchos experimentos en los que se utilizan anticuerpos fosforilados como agente bloqueador porque contiene muchas proteínas fosforiladas.

6. Stripping Reagent

La Stripping Solution es usada para eliminar restos de anticuerpos primarios y secundarios de las membranas de Western Blot. La necesidad de utilizar esta disolución es más acentuada cuando se están analizando varias proteínas en una membrana.

7. Fosfatasa alcalina del Anticuerpo conjugado Anti IgC de ratón (H+L), de conejo y de la molécula completa de IgG (Anti Mouse IgG (H+L), Rabbit, IgG Whole, Alkaline Phosphatase Conjugated)

Estos son algunos de los anticuerpos secundarios disponibles en los catálogos de Wako que son útiles en la técnica de Western Blot. También se pueden encontrar estos anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante.

8. Set de inmunotinción POD (POD Immunostain Set)

Este set incluye un kit para la inmunotinción enzimática con inmunoglobulinas marcadas con peroxidasa de rábano picante en membranas de nitrocelulosa. En presencia del reactivo colorante el fenol se oxida mediante la reacción con peróxido de hidrógeno, generándose el diformazán de color azul morado. Esta reacción permite la detección cuantitativa del antígeno, pues se puede medir por colorimetría la concentración del producto coloreado formado.

9. Disolución ABC (ABC Solution)

También es un colorante, en este caso el Complejo Peroxidasa-Biotina-Espreptadvina. La disolución ABC reacciona con los anticuerpos secundarios marcados con biotina para formar un complejo entre en antígeno, el anticuerpo primario, el anticuerpo secundario y ABC. Luego se adiciona el sustrato para la detección de las bandas correspondientes a las proteínas. Los antígenos pueden ser detectados con una alta sensibilidad usando esta disolución, ya que los anticuerpos secundarios se unen a múltiples peroxidasas via la espreptadivina.

10. Disolución BCIP/NBT (BCIP/NBT Solution)

La disolución de 5-bromo-4-cloro-3-indolfosfato (BCIP) y el nitroazul de tetrazolio (NBT) se usa también como reactivo colorante. El BCIP y el NBT generan un producto insoluble de color azul o morado muy oscuro en presencia de la fosfatasa alcalina. Esta reacción se aprovecha para realizar la detección de proteínas en el Western Blot.

REACTIVOS PARA BIOLOGÍA MOLECULAR:

Target mRNA Cloning Kit Wako GoldMAN™
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By: Lisa Komski In: Reactivos químicos Tags: Western Blot, Western Blot,