Equipo de reactivos SLP


Equipo de reactivos SLP

Equipo de reactivos SLP – Detección de microorganismos (detecta peptidoglucano de bacterias y hongos)

USO PREVISTO

El Equipo de reactivos SLP de Wako está destinado a la detección de peptidoglucano y (1 3)-D-glucano.

RESUMEN E INFORMACIÓN GENERAL

La hemolinfa del gusano de seda (Bombyx mori) contiene un mecanismo de autodefensa que se denomina sistema en cascada de la profenoloxidasa. Ante la invasión de un cuerpo extraño, como hongos o bacterias, el sistema en cascada participa en la formación de melanina que se observa en los líquidos corporales de insectos para protegerlos del ataque del invasor. El peptidoglucano (PG) de las bacterias y el (1 3)- -D-glucano ( -glucano) de los hongos y las levaduras accionan el sistema y, en consecuencia, se activa la profenoloxidasa en el sistema.

También se presupone que en el sistema en cascada participan las serinas proteasas en serie, pero se ha esclarecido poco en este punto.

 El plasma de larva de gusano de seda (SLP, silkworm larvae plasma) se prepara estéril y contiene todos los factores que participan en la activación del sistema en cascada. Este sistema, reconstituido con una solución que contiene L-3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) como sustrato de fenoloxidasa, es activado por un PG y/o -glucano.

La DOPA, oxidada por la fenoloxidasa, forma el pigmento de melanina en la mezcla de reacción.  El PG es un componente de la pared celular en la mayoría de las bacterias y el -glucano se encuentra comúnmente en la pared celular de una variedad de hongos. Por consiguiente, el SLP permite cuantificar o detectar la contaminación bacteriana y fúngica mediante la determinación del desarrollo de la formación de melanina en el ensayo.


Ref:
297-51501 Equipo de reactivos SLP

DATA

CARACTERISTICAS

  1. Cuantificación y detección sensibles de PG y -glucano.
  2. Cuantificación sensible y exacta de PG y -glucano mediante el uso de un lector de microplaca o Toxinómetro.
  3. Detección visual de contaminación bacteriana y fúngica sin ningún aparato especial.
  4. El SLP en forma liofilizada es estable a 2- 10 ºC durante un mínimo de 18 meses

PRINCIPIO

El mecanismo de activación de SLP es como se muestra en la Figura 1.

La PG o el glucano se unen a la proteína de reconocimiento llamada PGRP o GRP. El sistema de cascada de la profenoloxidasa se convierte en fenoloxidasa. La fenoloxidasa cataliza la oxidación del DOPA que es seguida por la formación de melanina en la mezcla.

Se puede calcular visualmente la reacción por el cambio de coloración de la mezcla de reacción después de un cierto periodo de tiempo, debido al desarrollo de un color negro.

Cuando se usa un lector de microplacas o Toxinómetro, se puede cuantificar el PG o el glucano midiendo el tiempo desde el inicio (Ta) de la reacción y el cambio de absorbancia ocasionada por el cambio de coloración desde el inicio de la reacción hasta un nivel predeterminado.

Equipo de reactivos SLP

REACTIVOS

Todos los reactivos deben almacenarse a 2-10 ºC.

1. SLP, liofilizado, 1 vial de 3 mL

Destinado para uso con lector de microplaca o tests visuales, rinde para aproximadamente 50 pruebas. Destinado para usarse con un Toxinómetro, rinde para aproximadamente 30 pruebas.

Sensibilidad: En cada lote se indican los criterios de valoración determinados por el test visual descrito a continuación después de 1 hora de incubación a 30 ºC con PG y -glucano.

2. Sustrato, liofilizado, 1 vial de 3 mL

Contiene DOPA como sustrato de fenoloxidasa.

3. Diluyente, 1 vial de 4 mL

Contiene una buena solución amortiguadora.

Preparación de reactivos

Añadir 3 mL de diluyente al sustrato. Agitar suavemente la mezcla para disolver el sustrato por completo. Evitar mojar el tapón de goma.

Añadir toda la disolución de sustrato reconstituida al vial de SLP liofilizado. Agitar suavemente hasta disolver por completo el producto liofilizado. De nuevo, evitar mojar el tapón de goma. La disolución resultante es la disolución de prueba de SLP.

PROCEDIMIENTO

1. Test visual con microplaca

  1. Hacer una serie de dilución doble con el material de referencia de PG o –glucano, añadir 0.05 mL de cada dilución y colocar la muestra en
  2. los pocillos de la microplaca.
  3. Volcar 0,05 mL de la disolución de prueba de SLP en cada pocillo.
  4. Después de agitar suavemente, incubar la placa a 30ºC durante una hora.
  5. Evaluar visualmente la formación de melanina en la mezcla de reacción: es una muestra positiva si se observa la formación de melanina y las otras muestras son negativas.
  6. La concentración mínima del material de referencia en el cual se forma la melanina se define como el criterio de valoración de la disolución de prueba de SLP.
  7. La determinación de si la muestra es negativa o positiva dependerá de si la concentración de los materiales reactivos de SLP que contiene la muestra es mayor o no, que la concentración del criterio de valoración.

2. Procedimiento con lector de microplaca

  • Se colocan 0.05 mL de las muestras y de las series de dilución de un material de referencia de PG o -glucano en cada pocillo de la microplaca.
  • Añadir 0.05 nM de la disolución de prueba de SLP en cada pocillo. Se recomienda el uso de un dispensador esterilizado consecutivo.
  • Leer la absorbancia del lector de la microplaca en las siguientes condiciones:

Absorbancia de la valoración: 650 nm

Modo de valoración: Cinético

Tiempo de inicio: 90 minutos

Temperatura de la valoración: 30

Automezcla: Una vez

  • La curva estándar se traza con una regresión log-log: eje horizontal: concentración de material de activación de SLP; eje vertical: tiempo de inicio.
  • Se calcula la concentración de material reactivo de SLP a partir del tiempo de inicio determinado con la curva estándar.

3. Procedimiento con Toxinómetro

Cuando se utiliza el Toxinómetro para la prueba de valoración con SLP, se puede efectuar el procedimiento de la misma manera que la valoración de endotoxinas descrita en el manual del operador. El Toxinómetro puede exhibir una señal que indique falta de luz de transmisión en la mezcla de reacción de la muestra activada. Ignore esta alarma. Los resultados no resultan afectados por la alarma.

Notas para el uso de SLP

  1. Los aparatos deben esterilizarse con calor seco a 250ºC durante al menos 2 horas y no deben contener ninguna contaminación con material de SLP reactivo.
  2. Después de la reconstitución, almacenar las disoluciones de prueba de SLP a 0-4 ºC y usarlas lo más pronto posible.
  3. Preste especial atención para evitar la contaminación de los aparatos con material de activación del SLP durante el almacenamiento.
  4. La sensibilidad de la disolución de prueba del SLP está influida en gran medida por la fuerza iónica.
  5. Este equipo solo es para el uso en investigación y no tiene utilidad en procedimientos de diagnóstico.
  6. Solo para uso in vitro. No es para uso interno en seres humanos o animales.