¿Cómo detectar un agente infeccioso que no está vivo? El ejemplo del SARS-CoV-2
El tratamiento eficiente de una enfermedad infecciosa muchas veces depende de la posibilidad de identificar su agente causal y así poder ofrecer un diagnóstico inequívoco de la enfermedad. Para ello, la práctica tradicional en los laboratorios clínicos es intentar aislar el organismo patógeno cultivándolo en condiciones específicas. Si bien este es un proceso laborioso, es de gran utilidad pues permite probar la susceptibilidad del microorganismo a distintos agentes antimicrobianos y así poder proponer el tratamiento más adecuado a la enfermedad.
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Los virus son agentes infecciosos que dependen de las células del hospedero para poder multiplicarse. No tienen una estructura celular ni un metabolismo propio, por lo que puede considerarse inertes. Si bien es posible cultivarlos en líneas celulares, la dificultad y costo del procedimiento limitan su uso. Es por esto que su diagnóstico se hace mediante un método indirecto, el cual detecta los anticuerpos producidos por el cuerpo como respuesta del sistema inmune.
En el caso del virus SARS-CoV-2, los anticuerpos de tipo IgG e IgM son detectables aproximadamente a partir del séptimo día tras el inicio de los síntomas. Debido a la variabilidad en la producción de anticuerpos en distintos pacientes, la OMS descarta la realización de las pruebas serológicas para el diagnóstico de COVID-19.
Debido a la gravedad de esta enfermedad, se ha vuelto prioritario el desarrollar métodos que permitan confirmar la presencia de SARS-CoV-2 de manera rápida y precisa. La prueba de RT-PCR en tiempo real permite detectar al virus hasta dos días antes del inicio de los síntomas y es señalado por la OMS como el método de confirmación de elección.
El virus de SARS-CoV-2 está rodeado de una envoltura y contiene ARN en su interior. Por ello, para su diagnóstico molecular por PCR es necesario realizar primero una retrotranscripción en la que una enzima (llamada transcriptasa inversa) sintetiza una cadena de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN. Este paso puede llegar a tomar hasta 1 hora en ensayos tradicionales.
Posteriormente, la enzima ADN polimerasa reconoce ciertos sitios del ADNc indicados por los cebadores (o primers) y replica la cadena de ADN. La efectividad de este ensayo depende del adecuado diseño de los primers, y su duración dependerá del tipo y velocidad de la ADN polimerasa. En los ensayos de PCR en tiempo real, se tiene además un indicador fluorescente que permite monitorear la cantidad de ADN amplificado en cada paso.
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Este kit permite realizar un ensayo de RT-PCR en tiempo real en un solo paso y reduce la duración total del ensayo a 45 minutos. Gracias al uso de una enzima de inicio en caliente y de alta actividad, que además actúa como transcriptasa inversa y ADN polimerasa, se obtiene una mejor especificidad y alta replicación en un tiempo menor. Adicionalmente, el kit usa dos primers que reconocen distintas secuencias en el gen N del virus, asegurando la confiabilidad del ensayo.
Para obtener buenos resultados es también primordial trabajar con una muestra de alta calidad. El ARN viral es extraído de la muestra biológica usando un buffer que ayuda a romper las células y liberar al material genético, al tiempo que debe evitar su degradación.
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Bibliografía:
- Organización Panamericana de la Salud. (2020). Directrices de laboratorio para la detección y el diagnóstico de la infección por el virus responsable de la COVID-19, 8 de julio del 2020. Recuperado de https://iris.paho.org/handle/10665.2/52471. Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0 IGO
- Salazar, A., Sandoval, A., & Armendáriz, J. (2013). Biología molecular. Fundamentos y aplicaciones en las ciencias de la salud (2ª ed). México: McGraw-Hill.
- Washington, J. A. (1996). Principles of diagnosis. En: Medical microbiology, 4ª ed. (pp. 134-43). Galveston (TX): University of Texas Medical Branch.
